|
Melknet Bis
|
De kiemgetalbepaling
Het kiemgetal in de melk wordt bepaald met de BactoScan FC
De Bactoscan FC is een volledig geautomatiseerd toestel gebaseerd op het principe van de flowcytometrie. Het melkmonster wordt behandeld met een chemisch reagens om enerzijds de invloed van storende melkcomponenten (vetglobulen, eiwitmicellen, somatische cellen) te reduceren en anderzijds de bacteriën te kleuren met behulp van de fluorescerende kleurstof ethidium bromide. Na kleuring worden de bacterën geteld via flowcytometrie.
Een uiterst smalle stroom van het monster passeert onder een opto-elektronische teleenheid (epifluorescentiemicroscoop). Deze vloeistofstroom wordt langs de teleenheid gevoerd door middel van een "sheath liquid" die als het ware een mantel vormt rond de vloeistofstroom.
De gekleurde bacteriën passeren één voor één langs de teleenheid. Fluorescentie wordt geactiveerd door een laser en het uitgestraalde licht door de gekleurde bacteriën wordt gedetecteerd. De lichtpulsen worden omgezet naat elektronische pulsen. Enkel de pulsen boven een bepaalde drempel worden geteld.
Het aantal gedetecteerde fluorescerende bacteriën wordt omgezet naar kolonievormende eenheden bepaald met de referentiemethode (Kochse plaatmethode) aan de hand van een conversietabel.
De celgetalbepaling
Het celgetal in de melk wordt bepaald met de Fossomatic 5000/FC
De Fossomatic 5000/FC is een volledig geautomatiseerd toestel gebaseerd op het principe van de flowcytometrie.
Het DNA van de somatische cellen wordt gekleurd met de fluorescerende kleurstof ethidium bromide. Na de kleuring wordt een uiterst smalle stroom van het monster onder een opto-elektronische teleenheid (epifluorescentiemicroscoop) gebracht. Deze vloeistofstroom wordt langs de teleenheid gevoerd door middel van een "sheath liquid", die een mantel vormt rond de vloeistofstroom. De uiterst smalle stroom is het gevolg van een vernauwing in de "flow cell" en de druk waarmee het monster door de cel wordt geperst. De cellen passeren één voor één langs de teleenheid. Hun fluorescentie wordt elektronisch versterkt en omgezet naar het aantal somatische cellen in duizendtallen per ml.
De remstoffenproef
De monsters worden eerst geanalyseerd met de Copan Milk Test. Dit is een microbiologische inhibitietest. Men laat een melkmonster diffunderen door een agartestmedium. Dit medium is geënt met sporen van het testorganisme Geobacillus stearothermophilus var. calidolactis en bevat voedingsstoffen, een pH-indicator en trimethoprim. Remstoffen aanwezig in het monster zullen de groei van het testorganisme verhinderen waardoor er geen zuurvorming zal plaats hebben en dus ook de kleur van de pH-indicator (broomcresolpurper) na de voorgeschreven incubatieduur ongewijzigd blijft in plaats van om te slaan naar geel.
De kleur van de voedingsbodem in de cups wordt aflezen met een vlakbedscanner. Na softwarematige verwerking wordt aan elke cup een colorimetrische waarde (CIF= Colour Impact Factor) toegekend. Deze colorimetrische waarde wordt vergeleken met een cut-off. Monsters waarvoor de kleur in de cups een waarde geeft groter dan of gelijk aan deze cut-off waarde worden als "verdacht" beschouwd.
Alle monsters die na de voorgeschreven incubatieduur van de screeningstest aanleiding geven tot een "verdacht" resultaat, worden onderworpen aan een eerste bevestigingsproef. Hiervoor wordt de betalactam-receptortest “beta s.t.a.r. 25” toegepast (beschrijving zie verder). Alle monsters die een resultaat geven lager dan of gelijk aan de cut-off vastgelegd voor deze receptortest zijn positief (aanwezigheid van remstoffen). Alle monsters die met de beta s.t.a.r. 25 een resultaat geven hoger dan deze cut-off worden onderworpen aan een tweede bevestigingsproef.
Deze tweede bevestigingsproef is identiek aan de screeningstest (Copan Milk Test) en wordt uitgevoerd op het monster na verwarming bij 80°C gedurende 10 minuten en op het monster behandeld met penicillinase.
Door de verwarming bij 80°C worden de hittelabiele remmende stoffen in de melk geïnactiveerd. Indien het resultaat op het verwarmde monster negatief is dan bevat het monster geen remmende stoffen.
Door de penicillinasebehandeling worden de betalactam-antibiotica en de cephalosporines geïnactiveerd. Indien het resultaat op dit monster positief is dan bevat de melk remmende stoffen die niet tot de groep van de betalactam behoren.
In het andere geval bevat de melk een kleine hoeveelheid betalactam.
Bij de receptortest wordt de melk geïncubeerd met een receptor waarbij mogelijke aanwezige antibiotica (betalactam) met de receptor kunnen binden. Na migratie wordt de resterende hoeveelheid vrije receptor gecontroleerd door vergelijking van de gevormde kleurintensiteit van de teststrook met de controlestrook. De kleurintensiteit ter hoogte van de teststrook is omgekeerd evenredig met de concentratie aan het antibioticum of chemotherapeuticum in het monster. De aflezing gebeurt met een reader. Bij de beta s.t.a.r. 25 is de receptor gebonden aan goudpartikels. Tijdens de eerste incubatiefase binden de eventuele beta-lactam antibiotica in het melkmonster zich aan de receptor. Tijdens de tweede incubatiefase migreert de melk op een immunochromatografische drager die twee captatiestroken vertoont. De eerste strook capteert alle receptoren die geen antibiotica hebben gebonden. De tweede strook dient als referentie.
Het vriespunt met MilkoScan 4000/FT6000
Het vriespunt wordt indirect bepaald via een spectrofotometrische lactosebepaling in het midden-infrarood gebied gekoppeld aan een geleidbaarheidsmeting. De apparatuur wordt gekalibreerd ten opzichte van de thermistorcryoscoop.
Vriespunt met de thermistorcryoscoop
Het te onderzoeken monster wordt onderkoeld in een bad van -3°C tot de gewenste temperatuur. Met behulp van een mechanische trilling wordt kristallisatie veroorzaakt, waardoor de temperatuur stijgt tot een plateau dat overeenkomt met het vriespunt van het monster. Dit plateau is het deel van de curve waarbij de temperatuur op +/-0,002°C na constant blijft gedurende een periode van minimum 20 seconden.
Het toestel wordt gekalibreerd door het zodanig in te stellen dat voor twee standaardoplossingen de juiste waarden worden verkregen bij toepassing van dezelfde werkwijze als voor de monsters melk. Onder deze voorwaarden geeft het plateau het vriespunt van de melk in graden Celsius.
De filtratieproef
De bepaling van de zichtbare zuiverheid van de melk gebeurt aan de hand van de filtratieproef. Hierbij wordt een bepaald volume melk met een apparaat gefilterd door een wattenschijfje. De beoordeling gebeurt door vergelijking met referentie-wattenschijfjes.
Het vet- en eiwitgehalte
Het vet- en eiwitgehalte wordt bepaald met de MilkoScan 4000/FT6000, d.i. een volledig geautomatiseerde midden-infrarood spectrofotometer. Na homogenisatie van het melkmonster wordt de hoeveelheid geabsorbeerd licht gemeten door :
* de carbonylgroepen van de esterverbindingen in de triglyceriden bij 5,7 µm en/of de CH-groepen bij 3,5 µm voor de bepaling van het vetgehalte;
* de secondaire amidebindingen in de peptiden bij 6,5 µm voor de bepaling van het eiwitgehalte.
De hoeveelheid van elke component wordt bekomen door een vergelijking met de absorptie die plaats heeft bij een andere golflengte waar deze component nagenoeg geen licht absorbeert. De wederzijdse beïnvloeding van de absorptie door de melkbestanddelen wordt gecompenseerd door het toepassen van intercorrectiefactoren.
De MilkoScan 4000 is uitgerust met een compact infrarood-systeem bestaande uit één straal, één cuvet en twee spiegels. De elf optische filters zijn gemonteerd op een wiel dat steeds in beweging is, waardoor de verschillende filters één voor één voor de infrarood-straal komen. De MilkoScan FT6000 is uitgerust met een Fourier Transform Infarood interferometer waarbij het gehele midden-infrarood gebied wordt gescand.
De toestellen worden gekalibreerd met behulp van melkmonsters waarvan het vet- en eiwitgehalte werd bepaald met respectievelijk de Röse-Gottlieb en de Kjeldahl methode.
Coliforme bacteriën
Het aantal coliforme bacteriën wordt bepaald met de Petrifilm-methode.
Een bepaalde hoeveelheid van het melkmonster wordt met een verdunnings- en pipeteerapparaat geënt op een "Petrifilm Coliform Count Plate". De Petrifilm platen worden geïncubeerd bij 30 °C gedurende 24 uur. Na incubatie worden de karakteristieke koloniën geteld met een automatische koloniënteller.
|
|
